Ossigenoterapia iperbarica per ustioni di secondo grado. Uno studio sperimentale nei conigli

INTRODUZIONE

Le ustioni sono tra le lesioni della pelle più devastanti, richiedono una gestione complessa e sono accompagnate da un’elevata morbilità e mortalità. Le lesioni termiche acute che richiedono cure mediche colpiscono circa mezzo milione di americani ogni anno, con circa 40.000 ricoveri e 3.400 morti. ¹ L’ossigenoterapia iperbarica (HBOT) è l’uso di ossigeno al 100% a pressioni maggiori della pressione atmosferica. Il paziente respira il 100% di ossigeno a intermittenza mentre la pressione della camera di trattamento è aumentata a oltre 1 atmosfera assoluta (ATA). Il trattamento delle ustioni con HBOT è stato esaminato per la prima volta a metà degli anni ’60 e ha attirato l’attenzione nei decenni seguenti, ma permangono controversie su potenziali rischi e costi. ²Il recente lavoro sui modelli di ratti ha dimostrato che l’HBOT riduce i tempi di guarigione e migliora l’aspetto delle cicatrici delle ustioni. ^{3 I} progressi nelle camere iperbariche hanno ridotto il costo complessivo associato al trattamento e studi clinici controllati sugli esseri umani stanno iniziando a produrre dati a sostegno della conclusione che l’HBOT è sicuro ed efficace per migliorare la guarigione delle ferite da ustione . ^4,5

I meccanismi post-ipotetici dell’HBOT con effetto benefico sulle ferite da ustione includono diminuzione della formazione di edema a causa della vasocostrizione iperoxic, aumento della formazione di collagene dalla sintesi accelerata di glicosamminoglicani e idrossilazione e miglioramento dell’uccisione fagocitica di batteri con normossia / iperossia. ⁶Inoltre, l’HBOT può ridurre la morbilità, ridurre la necessità di un intervento chirurgico (specialmente per le ustioni di secondo grado) e ridurre le lunghe degenze ospedaliere. ⁶ Tuttavia, questa modalità non è ancora accettata in modo uniforme.

Gli autori hanno deciso di condurre uno studio sperimentale sugli animali per rafforzare le prove per l’HBOT soprattutto nel trattamento delle ustioni di secondo grado. Lo scopo dello studio era di valutare gli effetti dell’HBOT sul danno da ustione di secondo grado inflitto ai conigli in termini di migrazione delle cellule infiammatorie, angiogenesi ed epitelizzazione.

Dichiarazione

Questo studio sperimentale è stato approvato dal Comitato etico per la ricerca biomedica presso l’Universitas Sam Ratulangi, Manado, Indonesia. I set di dati generati e / o analizzati durante questo studio sono disponibili dal primo autore su richiesta.

METODI

Questo studio ha coinvolto 36 conigli maschi della Nuova Zelanda con un peso medio di 1.200 a 1.400 ge contenuti in un’area di quarantena. Una lesione a spessore parziale (secondo grado) di 2 × 1 cm è stata inflitta sul retro di soggetti in anestesia generale utilizzando la somministrazione intramuscolare di ketamina (100 mg / kg di peso corporeo) come anestetico. Gli animali anestetizzati sono stati esposti alla fiamma diretta per 5-7 secondi attraverso una finestra di 1,5 × 1,5 cm in una rete di amianto.

I soggetti sono stati assegnati in modo casuale a due gruppi, 18 conigli in ciascuno. Il gruppo A (gruppo di intervento) ha ricevuto la terapia HBOT in sessioni di 90 minuti di 2,4 ATA per 6 giorni consecutivi, mentre il gruppo B (gruppo di controllo) non ha ricevuto alcun trattamento eccetto la pomata di vaselina sulla superficie della ferita. Al giorno 14, tutti i soggetti sono stati sottoposti ad eutanasia e l’area di ustione è stata asportata e inviata al laboratorio di patologia per l’esame istologico. Fette di tessuto standard sono state preparate e dipinte con ematossilina-eosina.

Le misure di esito istologico includevano il numero di cellule infiammatorie, l’angiogenesi e l’epitelizzazione. L’angiogenesi è stata determinata contando il numero di vasi sanguigni per mm ² . Tutte le misurazioni microscopiche sono state eseguite da un patologo indipendente, in cieco.

Per valutare l’infiammazione, le sezioni colorate e montate di ematossilina-eosina e CD68 (un marcatore monociti / macrofagi) sono state scansionate per la microscopia virtuale con ingrandimento 40 ×. Successivamente, utilizzando il software di microscopia virtuale NDP (Hamamatsu Photonics, Hammatsu City, Giappone), le immagini JPEG di tutte le sezioni tranne quelle colorate con ematossilina-eosina sono state scattate con ingrandimento 2,5 × (zoom digitale 10 ×) e caricate nel software CellD (Olympus Life Science , Amburgo, Germania) per l’analisi quantitativa computerizzata. Le soglie per il numero di pixel, tonalità, saturazione e intensità sono state impostate e verificate dall’occhio umano.

L’angiogenesi è stata esaminata con la densità del microvessel utilizzando un protocollo consolidato e validato. ^{7 Le} aree con la più alta densità di microvasi (hotspot vascolari) sono state identificate a basso ingrandimento delle sezioni colorate usando un microscopio ottico. All’interno di queste aree, i microvasi colorati individualmente sono stati contati a 400 ingrandimenti usando un reticolo a griglia quadrata con un campo di 0,0625 mm ². Cellule endoteliali positive colorate con transglutaminasi o cluster di cellule endoteliali separate da microvasi e elementi di tessuto connettivo erano considerati microrecipienti numerabili singolarmente; strutture ramificate con continuità della nave sono state contate come una. In caso di discontinuità, le strutture sono state contate come due vasi distinti. Tre campi per sezione di difetto sono stati contati nei punti caldi vascolari. La densità dei microvasi è stata definita come il punteggio medio di tutti e tre i campi per mm ² .

L’area epitelizzata è stata quantificata mediante morfometria computerizzata. Le aree di bruciatura sono state fotografate a una distanza di messa a fuoco fissa, utilizzando l’illuminazione identica in ogni occasione. È stata utilizzata una fotocamera Minolta SRT MC-II (Konica Minolta, Tokyo, Giappone) montata su un supporto e dotata di obiettivo macro-obiettivo da 100 mm, unitamente a un lotto uniforme di pellicola a colori AGA 100 ASA. Le aree di epitelizzazione sono state contrassegnate e le fotografie sono state poi convertite in un display digitale utilizzando un sistema di analisi morfometrica computerizzato e sono stati quantificati l’area della ferita e le aree di epitelizzazione (Image Measure Software, Phoenix Corporation, Seattle, Washington).

È stato eseguito un test Kolmogorov-Smirnov per determinare se i due set di dati fossero normalmente distribuiti. Un test U di Mann-Whitney è stato utilizzato per confrontare le differenze tra i due gruppi. P <.05 è stato considerato significativo.

RISULTATI

Tutti i soggetti hanno completato con successo i 14 giorni di osservazione e sono stati sottoposti a eutanasia. L’esame istologico ha mostrato che il gruppo A (HBOT) aveva meno cellule infiammatorie e angiogenesi e aveva più epitelizzazione rispetto al gruppo di controllo ( Tabella ).

Il test di Kolmogorov-Smirnov ha mostrato che i dati non erano distribuiti normalmente, quindi le differenze tra i due gruppi sono state analizzate con un test U di Mann-Whitney . C’erano differenze significative tra i gruppi A e B in termini di cellule infiammatorie ( P = .025) e epitelizzazione ( P = .024; Figura ), mentre non c’era alcuna differenza significativa per l’angiogenesi ( P = .442).

DISCUSSIONE

Le ustioni sono classificate per profondità in ustioni superficiali (epidermiche), a spessore parziale ea tutto spessore. ⁸ Il danno tissutale non è solo causato dall’incitamento da solo; l’infiammazione prolungata si traduce in un accumulo di citochine citotossiche e di radicali liberi, insieme al tamponamento dei neutrofili delle venule dermiche. L’aumento della permeabilità vascolare e l’aumento della pressione idrostatica interstiziale portano ad edema con congestione vascolare. L’ipercoagulabilità con trombosi compromette ulteriormente il flusso sanguigno, mentre lo stress ossidativo danneggia le cellule endoteliali e compromette la pervietà vascolare. L’onere principale è il mancato apporto di ossigeno e sostanze nutritive alle cellule danneggiate. ⁹

Numerosi studi hanno studiato l’utilità di vari agenti nel modulare i meccanismi della progressione della ferita da ustioni . Durante l’HBOT, pressioni di ossigeno superiori a 1 ATA aumenteranno la pressione del gradiente di O ₂ per promuovere la diffusione dell’ossigeno nei tessuti. L’ossigeno può anche dissolversi nel plasma e può raggiungere il tessuto carente di ossigeno attraverso la macro e la microcircolazione. ^10,11

Riduzione delle cellule infiammatorie

Il numero di cellule infiammatorie è diminuito dopo l’HBOT. Un precedente studio di Thom ^{12 ha} dimostrato che l’inibizione mediata da 2,8 a 3-ATA di HBOT dell’integrina di β2 neutrofilo. Un evento precoce associato alla riperfusione del tessuto postischemico è l’aderenza dei neutrofili circolanti all’endotelio vascolare da parte delle integrine β2. Quando gli animali o esseri umani sono esposti a ossigeno iperbarico per almeno 45 minuti, la capacità di neutrofili circolanti di aderire ai tessuti bersaglio è temporaneamente inibita, ¹³ riducendo così il numero di cellule infiammatorie all’interno della cavità della ferita. Questa inibizione iperbarica mediata dall’ossigeno dell’associazione di integrina β2 dei neutrofili ha anche dimostrato di migliorare le lesioni da riperfusione. ¹⁴

La dose di pressione dell’ossigeno in questo studio era di 2,4 ATA. Questo è inferiore a Bilic et al ⁶ (2,5 ATA) e ad altri studi, in cui l’intervallo di pressione era compreso tra 2 e 3 ATA; tuttavia, questa dose più bassa ha mostrato lo stesso effetto in termini di numero di cellule infiammatorie all’interno della cavità della ferita. I futuri studi HBOT possono esplorare il punto di cut-off ottimale per il dosaggio iperbarico basato su questo risultato.

Teoricamente, l’HBOT non inibisce la funzione antibatterica dei neutrofili poiché il percorso “dentro-fuori” della proteina G accoppiato per attivazione (come quello attivato dall’endotossina) rimane intatto e la nitrosilazione S dell’actina è invertita come componente di questo processo di attivazione. ¹⁴ Sebbene molti temono che HBOT può inibire temporaneamente l’aderenza dei neutrofili circolanti tessuti bersaglio, con conseguente immunocompromissione, la prova più convincente deriva da studi in modelli di sepsi, dove HBOT ha un effetto benefico. ^15,16 Un percorso antinfiammatorio separato per HBOT comporta anche una ridotta produzione di citochine proinfiammatorie da parte dei macrofagi monociti. Questa azione è stata mostrata in modelli animali e esseri umani. ^17,18L’effetto sui monociti può essere la base per livelli ridotti di citochine proinfiammatorie circolanti in condizioni di stress. ¹⁹

Diminuzione dell’angiogenesi

Gli stimoli angiogenetici regionali influenzano l’efficienza della nuova crescita dei vasi sanguigni da parte delle cellule endoteliali locali (denominata angiogenesi) e queste cellule stimolano il reclutamento e la differenziazione delle cellule staminali / progenitrici circolanti per formare nuovi vasi (vasculogenesi). ²⁰ E ‘postulato che HBOT ha effetti benefici sulla questi processi. Vari studi con macrofagi in coltura, nel fluido della ferita, utilizzando modelli di ratto e in volontari umani hanno dimostrato che l’HBOT aumenta la produzione di fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF). ²¹ Esistono vari meccanismi proposti su come HBOT lo fa. Un meccanismo implica semplicemente la correzione dell’ipossia della ferita. Come parte del processo emostatico di guarigione delle ferite, vasocostrittore capillare, che aumenta la distanza di diffusione che l’ossigeno deve attraversare per raggiungere le cellule endoteliali. Dato che il VEGF richiede ossigeno, la maggiore distanza di diffusione diminuisce la quantità di ossigeno disponibile per VEGF. L’efficacia di HBOT è nell’aumento dei gradienti di pressione parziale dell’ossigeno tra tessuti sani e ipossici.

Aumento dell’epitelizzazione

L’ossigenoterapia iperbarica influenza teoricamente l’epitelizzazione delle ustioni di secondo grado minimizzando l’effetto distruttivo dell’ipossia e incoraggiando un più rapido tasso di mitosi delle cellule epiteliali e la migrazione cellulare alla cavità della ferita. In pratica, tuttavia, studi precedenti hanno stabilito risultati contrastanti sul fatto che l’HBOT aumenti il ​​tasso di epitelizzazione nelle ustioni di secondo grado. ^22-24 Korn et al. ^{22 hanno} affermato che le cellule epiteliali possono sopravvivere senza ossigeno per un po ‘, ma non possono dividersi e migrare. È possibile che l’HBOT aumenti l’ossigenazione del tessuto ipossico che potrebbe non sopravvivere senza ossigeno aggiuntivo durante l’ischemia. ²⁵Il presente studio ha dimostrato una più rapida epitelizzazione nel gruppo di intervento rispetto al gruppo di controllo, che supporta la conclusione che l’ossigeno adeguato è obbligatorio per la guarigione della ferita .

Limitazioni e raccomandazioni per la ricerca futura

L’angiogenesi inizia durante la fase di proliferazione, che può protrarsi fino a 3 settimane dopo l’infortunio. Tuttavia, questo studio non ha rivelato alcuna differenza significativa nell’angiogenesi tra HBOT e gruppi di controllo. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che i conigli sono stati sottoposti ad eutanasia dopo 14 giorni, quando la fase di proliferazione era ancora in corso. È possibile che uno studio condotto per un periodo di tempo più lungo comporti differenze significative.

Sono necessari ulteriori studi per valutare l’efficacia clinica di HBOT nell’uomo per determinare la dose ottimale di ATA e quante sedute sono necessarie. Come ogni terapia medica, il rischio e i benefici di HBOT devono essere attentamente valutati. Uno pneumotorace non trattato è l’unica controindicazione assoluta all’HBOT.

CONCLUSIONI

Questi risultati mostrano che l’HBOT ha un effetto benefico sulla guarigione della ferita da ustioni riducendo l’edema e assicurando che vi sia un adeguato apporto di ossigeno nella microcircolazione. Può accelerare l’epitelizzazione e sopprimere l’infiammazione non necessaria che potrebbe influire negativamente sulla normale cicatrizzazione delle ferite. Con ulteriori ricerche, HBOT può diventare una terapia adiuvante per la chirurgia.

[Tratto da: www.journals.lww.com ]