Espressione dell’attivatore del recettore del ligando del fattore-kB nucleare in cellule mononucleate del sangue periferico in pazienti con neuroartropatia acuta di Charcot

La neuroartrosi di Charcot (CN) si verifica in genere nel piede / alla caviglia di pazienti diabetici con neuropatia sensoriale ed è una causa comune di morbilità in questa popolazione. Questa malattia può portare ad una grave amputazione dei piedi: in questi casi, l’osteomielite è stata descritta come meccanismo scatenante dello sviluppo di CN, pertanto un’efficace terapia antibiotica potrebbe avere un ruolo positivo nel corso della malattia. La CN è presto caratterizzata da un’infiammazione acuta che può causare osteopenia, riassorbimento osseo e indebolimento osseo che successivamente possono portare a alterazioni ossee croniche come fratture, lussazioni, instabilità e deformità grossolane ^1 – 3. Infatti, l’infiammazione locale è associata al rilascio di citochine proinfiammatorie come l’interleuchina (IL) -1alfa e il fattore di necrosi tumorale (TNF) -alfa, che sono noti mediatori del riassorbimento osseo tramite attività osteoclastica in eccesso ^4 , 5. Queste citochine portano ad una maggiore espressione dell’attivatore del recettore del ligando nucleare factor-kB (RANK) (RANK-L). Il suo recettore (RANK) è espresso nella membrana dei preosteoclasti. Il RANK-L stimola l’espressione del fattore nucleare (NF) -kB che, a sua volta, induce la maturazione delle cellule precursori in osteoclasti maturi. Allo stesso tempo, NF-kB induce la glicoproteina osteoprotegerina (OPG), che agisce come recettore di decoy per RANK-L per evitare l’osteolisi in eccesso. Il ruolo di questa via nella patogenesi acuta di CN è supportato dal fatto che lo stesso sistema RANK / RANK-L / OPG è anche coinvolto nel processo di calcificazione arteriosa mediale una caratteristica fortemente associata a CN ^6 , 7 . Le cellule T e B attivate sono fonti ben riconosciute di RANK-L e OPG ^8, 9 , e può contribuire a riassorbimento osseo patologico visto nelle malattie infiammatorie croniche come l’artrite reumatoide (RA), periodontite e la malattia infiammatoria intestinale ^10 – 13 . Il CN acuto non è associato con l’infiammazione sistemica ¹⁴ , tuttavia, i monociti periferici da pazienti con CN acuta possono mostrare cambiamenti pro-infiammatori ¹⁵ . Sulla base di queste evidenze, in questo studio l’espressione di RANK-L e OPG è stata studiata in cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da pazienti con CN acuto e correlata con i marcatori clinici e radiologici dell’attività della malattia. Abbiamo trovato che l’espressione di RANK-L era inferiore nei pazienti con CN acuto rispetto ai soggetti di controllo diabetici e ai soggetti sani di controllo; mentre l’espressione di OPG non è stata rilevata nei pazienti e in entrambi i gruppi di controllo. L’espressione di RANK-L all’inizio della malattia era inversamente correlata all’indice di polinsaturazione (PUI), un indice misurabile derivato dal midollo osseo che consente la valutazione dell’attività della malattia nella CN acuta ¹⁶e tempo di recupero. Infine, l’espressione di RANK-L è aumentata al momento della guarigione rispetto ai valori rilevati durante la fase acuta.

Reclutamento dei pazienti

Nove pazienti diabetici con CN acuta sono stati arruolati in modo prospettico nello studio. La CN acuta è stata definita sulla base dei seguenti segni clinici e MRI: inspiegabile, relativamente indolore, aumento del gonfiore di un piede e della caviglia, aumento della temperatura della pelle di almeno 2 ° C rispetto al piede controlaterale (delta-T), instabilità clinica dovuta a lesione legamentosa / trauma occulto, presenza di edema tipico del midollo osseo sulla risonanza magnetica. Tutti i pazienti erano nello stadio 0, secondo Eichenholtzsistema di palcoscenico ed erano privi di qualsiasi osso strutturale o alterazione articolare, come documentato da valutazione tomografica computerizzata, ulcere del piede attivo e / o segni di infezione dei tessuti molli. Tutti i pazienti hanno avuto un coinvolgimento unilaterale del piede come documentato dalla risonanza magnetica (nessuna evidenza di edema del midollo osseo), oltre alla valutazione clinica. Tutti i pazienti presentavano una grave polineuropatia sensoriale periferica. La presenza di neuropatia periferica è stata valutata mediante la soglia di percezione delle vibrazioni (VPT espressa in Volt) e l’indice di neuropatia diabetica (DNI). La neuropatia periferica è stata definita da un VPT ≥25 Volt e / o da un punteggio DNI positivo> 2 punti ¹⁷. In seguito alla diagnosi di CN acuta, tutti i pazienti sono stati sottoposti a scaricamento e immobilizzazione del piede mediante getto di contatto totale seriale con progressione verso cast castatori rimovibili. Il recupero è stato definito dalla scomparsa dell’edema del midollo osseo, come dimostrato dalla RMN, utilizzando immagini TIR (TIR) ​​con recupero dell’inversione del tao corto pesate in T2. È stato anche studiato un gruppo (n = 9) di pazienti diabetici con polineuropatia sensoriale periferica, senza evidenza clinica e radiologica della storia della NC. Sono stati inclusi anche controlli sani (n = 9) senza evidenza di diabete mellito (in base all’assenza di farmaci antidiabetici auto-riportati). Questo studio è stato condotto secondo i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki e approvati dal nostro comitato di revisione istituzionale.

RT-PCR

L’RNA totale è stato isolato nei pazienti e nei controlli entro 24 ore dall’incontro dei criteri di iscrizione utilizzando l’uso del kit RNeasy Plus Mini (Qiagen, Hombrechtikon, Svizzera), comprensivo della digestione con DNasi-I e quindi dell’etanolo precipitato. La quantificazione dell’RNA isolato è stata eseguita mediante determinazione spettrofotometrica (Gene Quant II, Pharmacia, Uppsala, Svezia). RNA totale è stato retrotrascritto al cDNA utilizzando Omniscript RT Kit (Qiagen): RNA (1 microgrammo) è stato aggiunto a una provetta contenente 2 microlitri 10x tampone RT, 2 microlitri dNTP Mix (5 mM ogni dNTP), 2 microlitri Oligo dT primer (10microM), 2 microlitri Esameri random (100microM), 1microliter inibitore Qiagen-RNase (10 unità / microl), 1microliter Omniscript Reverse Transcriptase (4 unità / microl), quantità variabile di acqua senza RNasi in un volume di reazione totale di 20 microlitri. Le condizioni di incubazione erano 60 min a 37 ° C. Le diluizioni seriali del cDNA sono state amplificate mediante PCR utilizzando AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase (Applied Biosystems): cDNA è stato aggiunto a una provetta contenente 5 microlitri 10x AmplTaq Gold 360 Buffer, 5 microlitri 25mM Magnesium Chloride, 4 microlitri dNTP Mix (2,5 mM ogni dNTP), 1 microlitro di ciascun primer (25microM), 0,25 microlitri AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase (5 unità / microlitro), acqua per PCR in un volume di reazione totale di 50 microlitri. La reazione è stata eseguita su GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Primer umani specifici per mRNA da geni RANK-L e OPG sono stati utilizzati in PCR, la beta-actina è stato il gene housekeeping selezionato come standard interno. I primer utilizzati erano: RANK-L forward, 5′-CAGATGGATCCTAATAGAAT-3 ‘, RANK-L reverse, 5′-ATGGGAACCAGATGGGATGTC-3’, OPG forward, 5 ‘ -ATGAACAAGTTGCTGTGCTG-3 ‘, OPG reverse, 5′-GCAGAACTCTATCTCAAGGTA-3′, beta-actin forward, 5’-CGTACCACTGGCATCGTGAT-3 ‘, beta-actin reverse, 5′-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3’. Il profilo termico per amplificare il DNA era: denaturazione iniziale a 95 ° C per 10 min seguita da un numero selezionato di cicli costituiti da denaturazione a 95 ° C per 1 min, ricottura (a temperatura dipendente dalla temperatura di fusione T di ciascuna coppia di primer) per 30 sec, estensione a 72 ° C per 1 min, con un’estensione finale a 72 ° C per 7 min. La temperatura di ricottura era: 54 ° C per OPG, 46 ° C per RANKL, 58 ° C per beta-actina. Il numero di cicli era: 35 per RANK-L, 50 per OPG, 21 per beta-actina. La lunghezza del prodotto di amplificazione era: 324 bp per RANK-L, 354 bp per OPG, 452 bp per beta-actina. L’assenza di contaminazione del DNA nella preparazione dell’RNA è stata verificata effettuando l’amplificazione PCR locus HLA-DQa 1 (primer forward GH26, 5-GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG-3 ‘, primer inverso GH27, 5′-CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTTG-3’, temperatura di ricottura 60 ° C, dimensione di prodotto 242 bp, o 239 bp da alcuni alleli). 10ml del prodotto di amplificazione da ciascuna PCR sono stati separati su gel di agarosio all’1,8%, colorati con bromuro di etidio e visualizzati mediante irradiazione UV. Le bande di bromuro di etidio sono state acquisite mediante scansione e quantificate mediante analisi di immagini con Multi-Analyst / PC (software per PC per Image Analysis Systems 1.1 di Bio-Rad.) o 239 bp da alcuni alleli). 10ml del prodotto di amplificazione da ciascuna PCR sono stati separati su gel di agarosio all’1,8%, colorati con bromuro di etidio e visualizzati mediante irradiazione UV. Le bande di bromuro di etidio sono state acquisite mediante scansione e quantificate mediante analisi di immagini con Multi-Analyst / PC (software per PC per Image Analysis Systems 1.1 di Bio-Rad.) o 239 bp da alcuni alleli). 10ml del prodotto di amplificazione da ciascuna PCR sono stati separati su gel di agarosio all’1,8%, colorati con bromuro di etidio e visualizzati mediante irradiazione UV. Le bande di bromuro di etidio sono state acquisite mediante scansione e quantificate mediante analisi di immagini con Multi-Analyst / PC (software per PC per Image Analysis Systems 1.1 di Bio-Rad.)

Esami MR

La MRS e la RM sono state eseguite utilizzando un sistema di scanner 3-T (Achieva, Philips Medical Systems, Best, Paesi Bassi). La presenza o l’assenza di edema del midollo osseo all’interno di diverse ossa del piede e della caviglia è stata determinata utilizzando immagini TIR (TIR) ​​con recupero di inversione di breve durata (STIR) acquisite nei piani coronale, assiale e sagittale. I dati spettroscopici sono stati ottenuti come descritto in precedenza utilizzando una sequenza spettroscopica a singolo punto di voxel (PRESS) come precedentemente descritto ¹⁶. In breve, la sequenza PRESS è stata soppressa con acqua utilizzando un impulso di eccitazione selettivo per schiacciare il segnale dell’acqua. La dimensione voxel (volume di interesse, VOI) era 1,3 × 1,3 × 1,3 cm3. Le operazioni di determinazione della frequenza, di ottimizzazione della potenza e di spessoramento completamente automatizzate sono state eseguite nel VOI. Per confermare la riproducibilità delle misurazioni, sono stati ripetuti tre insiemi di acquisizione degli spettri tre volte ciascuno in quattro 4 pazienti e sei 6 soggetti di controllo. I dati sono stati analizzati utilizzando il pacchetto software jMRUI v4.0 ¹⁸ . I metaboliti da stimare sono stati definiti con un database di riferimento di picchi noti ¹⁹ . Gli spettri acquisiti sono stati analizzati utilizzando l’algoritmo di AMARES. L’indice del rapporto metabolita della poli-insaturazione (PUI) è stato definito come descritto in precedenza ¹⁶ .

Risultati clinici

Le caratteristiche cliniche generali dei diversi gruppi di pazienti sono presentate nella Tabella 1 . L’età media, rapporto maschi-femmine era simile tra pazienti con CN acuto e soggetti di controllo diabetici (p> 0,05 e p> 0,05, rispettivamente) o partecipanti di controllo sani (p> 0,05 e p> 0,05, rispettivamente). Inoltre, il tempo trascorso dall’esordio del diabete e la percentuale di Hba1c non erano diversi tra pazienti affetti da CN acuto e soggetti con controllo diabetico (p> 0.05 e p> 0.05, rispettivamente). Tutti i pazienti diabetici erano in terapia insulinica. Il sito della lesione nei pazienti con CN acuta era il piede posteriore, n = 6; metà del piede, n = 3 e il tempo medio di guarigione sulla risonanza magnetica era di 8,14 ± 3,7 mesi.

Espressione RANK-L e OPG in PBMC

La RT-PCR semi-quantitativa è stata eseguita su RNA totale estratto da PBMC in pazienti con CN acuto, soggetti di controllo diabetico e partecipanti di controllo sani. Come mostrato nella Figura 1 , l’espressione di RANK-L è stata rilevata nella totalità dei pazienti e dei controlli, ma era significativamente più bassa nei pazienti rispetto ai controlli, come dimostrato dalla valutazione densitometrica dei prodotti di amplificazione da PCR. Nessuna differenza significativa nell’espressione di RANK-L è stata documentata tra soggetti di controllo diabetici e partecipanti di controllo sani. Espressione di OPG abbondante è stata evidenziata nella linea di cellule positive di controllo U937 ma, a differenza di RANK-L, non è stata rilevata alcuna espressione di OPG in PBMC da pazienti e controlli.

L’espressione RANK-L è correlata con PUI e tempo di recupero

Abbiamo poi studiato se l’espressione di RANK-L nei pazienti acuti di CN fosse correlata con PUI e tempo di guarigione alla risonanza magnetica. L’analisi di correlazione di Pearson ha mostrato che l’espressione di RANK-L era inversamente correlata con i livelli di PUI (r = -0.7072, intervallo di confidenza del 95% = -0.9331 a -0.0810, P = 0.033) e tempo di recupero (r = -0.7878, intervallo di confidenza al 95% = – Da 0,9532 a -0,2592, P = 0,011) ( Fig. 2 ).

Il recupero dal CN acuto è associato ad un aumento dell’espressione di RANK-L

L’espressione di RANK-L è stata analizzata in sei pazienti durante la fase acuta della CN e al momento della scomparsa dell’edema del midollo osseo ( Fig. 3 ). La valutazione densitometrica dei prodotti di amplificazione da PCR non ha mostrato una differenza significativa dell’espressione RANK-L tra i due punti temporali; tuttavia, in tutti i pazienti l’espressione di RANK-L è aumentata al momento della guarigione rispetto ai valori rilevati durante la fase acuta.

Discussione

Il coinvolgimento del riassorbimento osteoclastico mediato da RANK-L nella CN acuta è supportato da diversi studi ^6 , 7 . Il sistema immunitario adattativo influisce potenzialmente sullo scheletro attraverso una convergenza di cellule immunitarie e effettori di citochine, mediando funzioni critiche in entrambi i sistemi di organi e formando l ‘”interfaccia immuno-scheletrica”. In condizioni infiammatorie sia le cellule B che le cellule T possono essere considerevoli fonti di RANK-L e possono contribuire al riassorbimento osseo patologico ^10 – 13. Tuttavia, nel CN ​​acuto la risposta infiammatoria locale correlata all’aumentata secrezione di citochine proinfiammatoria non è associata a una sindrome infiammatoria sistemica (14). Qui abbiamo trovato che l’espressione di RANK-L era inferiore in PBMC da pazienti con CN acuta rispetto a soggetti di controllo diabetici e controlli sani. Questi dati suggeriscono l’esistenza di un meccanismo immunoregolatore compensatorio per limitare potenzialmente il riassorbimento osseo durante la CN acuta. La modulazione in basso dell’espressione RANK-L può essere ottenuta riducendo la produzione di citochine come IL-18, IL-1beta e TNF-alfa, che aumentano la produzione di RANK-L da parte dei linfociti ²⁰ , o aumentando la secrezione di citochine, come IL-27, in grado di inibire l’espressione di RANK-L su cellule T ^21 – 24. Al contrario di RANK-L, nessuna espressione di OPG è stata rilevata nelle cellule da pazienti e controlli. Ciò non sorprende poiché i linfociti esprimono l’OPG solo dopo l’attivazione in risposta alla sfida dell’antigene, che non è un meccanismo patogenetico della CN acuta. In particolare, l’assenza di OPG espressione da PBMC è coerente con l’intenso riassorbimento osseo che caratterizza la fase acuta di CN.

Il CN acuto si presenta tipicamente con un’infiammazione acuta o sub acuta del piede. Il dolore può o non può essere presente, a seconda della presenza di danni ai nervi ⁵ . Non c’è né febbre né alcuna sindrome infiammatoria biologica importante, e questa presentazione clinica ha spesso portato a diagnosi imprecise o ritardate, con conseguente progressione verso la fase cronica con deformazione irreversibile. Il riconoscimento precoce di CN può salvare un lungo periodo di sofferenza per il paziente, costi ospedalieri elevati e, in definitiva, l’amputazione. Tuttavia, in questa fase della malattia, la radiografia standard spesso non è in grado di distinguere il CN acuto da altre condizioni. La scintigrafia ossea radioisotopica del tecnezio (TC-99m) ha una buona sensibilità ma scarsa specificità per la patologia ossea ²⁵. La risonanza magnetica è in grado di evidenziare un’infiammazione nell’osso e nei tessuti molli adiacenti, ma è piuttosto costosa e richiede un alto livello di competenza dall’esaminatore ²⁶ . I dati presentati qui suggeriscono che la valutazione dell’espressione di RANK-L nei globuli periferici potrebbe rappresentare un possibile nuovo strumento diagnostico. Tuttavia, la diagnosi differenziale di CN acuta deve essere effettuata con infezioni (osteomielite, cellulite, artrite settica) e infiammazioni (ad esempio la gotta). Non abbiamo valutato l’espressione di RANK-L in soggetti con infezione o infiammazione diversa dalla CN, quindi il lavoro futuro dovrebbe concentrarsi, oltre che sull’analisi di conferma, sulla discriminazione dell’infezione / dell’infiammazione rispetto a CN.

Fino ad oggi la valutazione dei pazienti acuti di CN si è basata su segni infiammatori locali come temperatura cutanea, gonfiore ed eritema ^{5 , 27 , 28} . I segni clinici locali sono utili per guidare il medico a passare dal cast ad altri dispositivi per alleviare la pressione. Tuttavia, sono affetti da scarsa specificità e riproducibilità e la loro utilità nel fornire una misura del livello di attività della malattia è stata recentemente messa in discussione ^29 , 30. La mancanza di criteri specifici e indici oggettivi in ​​grado di valutare l’attività della malattia durante il follow-up, oltre ad essere un ostacolo all’attuazione delle attuali opzioni terapeutiche fisiche, ha limitato anche la ricerca sui trattamenti farmacologici per la CN acuta. Recentemente, la risonanza magnetica è stata introdotta nella valutazione della CN acuta. In particolare, la scomparsa dell’edema del midollo osseo come valutato sulle immagini STIR si è rivelata utile per valutare il recupero della malattia ³¹ . Tuttavia, durante il periodo tra l’inizio della malattia (presenza di edema del midollo osseo) e il recupero (assenza di edema del midollo osseo) la regressione dell’edema del midollo osseo è difficile da quantificare ³² . L’uso della risonanza magnetica contrastata è stato sostenuto ^32 , 34. Tuttavia, nei pazienti diabetici non sono sempre possibili esami ripetuti con mezzo di contrasto ³⁴ . In questo contesto clinico, un indice quantitativo non invasivo sarebbe altamente desiderabile per monitorare l’attività della malattia. A questo proposito, mostriamo qui che il grado di espressione di RANK-L in PBMC da pazienti affetti da CN acuta è correlato all’intensità dell’infiammazione del midollo osseo, valutata dalla MRS. Inoltre, l’espressione di RANK-L era significativamente più bassa nei pazienti il ​​cui edema del midollo richiedeva più tempo per risolversi. Infine, dopo la sparizione dell’edema del midollo osseo, l’espressione di RANK-L valutata su base singola paziente è aumentata rispetto ai valori ottenuti all’inizio della malattia.

Conclusioni

In conclusione, i nostri dati preliminari forniscono un primo passo nell’applicazione dell’analisi dell’espressione di RANK-L nelle cellule del sangue periferico alla diagnosi di CN acuta. L’espressione RANK-L potrebbe essere correlata a una vasta gamma di patologie ossee degenerative, come l’artrite reumatoide, pertanto è necessario eseguire una diagnosi differenziale adeguata. La patogenesi della CN rimane incerta e tuttavia, sulla base dei nostri dati, suggeriamo che l’analisi dell’espressione RANK-L potrebbe essere uno strumento complementare che può essere impiegato per ottenere parametri quantitativi che possono aiutare i medici a monitorare l’attività della malattia nei pazienti con CN acuta.

[Tratto da: www.medsci.org ]