Valutazione del ruolo della proteina Box 1 di gruppo ad alta mobilità nei pazienti con cheloidi: uno studio caso-controllo

I cheloidi sono anormalità della guarigione della ferita caratterizzata da un’eccessiva produzione di collagene nella pelle. Oltre ai problemi estetici causati da un aspetto sollevato e rosso, i cheloidi possono causare dolore, prurito e contratture. I cheloidi sono visualizzati come cicatrici che crescono oltre i confini della ferita originale e raramente regrediscono nel tempo. Sebbene osservati nei pazienti di tutte le razze, i cheloidi hanno una maggiore presenza in individui di pelle scura, con un’incidenza del 6% – 16% nelle popolazioni africane. ¹

I grandi cheloidi possono derivare da lievi ferite alla pelle, come acne e piercing. ^{2 I} cheloidi si sviluppano da un equilibrio improprio tra deposizione e degradazione delle componenti della matrice extracellulare (ECM), in particolare il collagene. Il collagene in eccesso è prodotto da fibroblasti malfunzionanti a causa della maggiore densità e attivazione dei recettori del fattore di crescita. ³

La proteina box 1 di gruppo ad alta mobilità (HMGB1) ha due funzioni. Come fattore di trascrizione intracellulare, HMGB1 si lega al DNA piegato per promuovere l’assemblaggio di complessi nucleoproteici, che è fondamentale nei processi di trascrizione, ricombinazione, replicazione e riparazione. Come mediatore extracellulare, HMGB1 agisce come una potente citochina infiammatoria. ^{4 Il} rilascio di HMGB1 avviene attivamente da monociti stimolati e macrofagi e passivamente da cellule necrotiche / danneggiate. ⁵ La proteina esercita i suoi effetti legandosi ai recettori della superficie cellulare, in particolare il recettore del prodotto finale della glicazione (RAGE) e il recettore toll-like (TLR) 2 e TLR4. ⁶Influisce sulla cicatrizzazione delle ferite legandosi principalmente al RAGE, quindi traslocando nel nucleo dove presumibilmente altera l’espressione genica, con conseguente aumento della vitalità, proliferazione e migrazione dei cheratinociti e dei fibroblasti. Diversi studi ^4,7 hanno chiarito un potenziale ruolo di HMGB1 nella guarigione delle ferite nei modelli murini e umani. 

Nella pelle murina diabetica con livelli di HMGB1 ridotti e cicatrizzazione alterata della ferita, l’aggiunta di HMGB1 ha aumentato la migrazione dei fibroblasti e il tasso di chiusura della ferita. 7 Sebbene questi studi ^4,7 supportino il ruolo di HMGB1 come promotore della chiusura della ferita, il ruolo di HMGB1 nelle cicatrici rimane poco chiaro. Aumentando la vitalità, la proliferazione e la migrazione dei fibroblasti, presumibilmente HMGB1 potrebbe contribuire come una molecola profibrotica per produrre collagene.

Dardenne et al. ^{8 hanno} riferito che HMGB1, quando applicato a ferite cutanee murine precoci (prima del 16 ° embrionale) che normalmente guariscono con l’assenza di tessuto cicatriziale, inducono la guarigione delle ferite con cicatrici e cicatrici. Inoltre, vi è stato un aumento dose-dipendente della dimensione della cicatrice, del numero di fibroblasti e della deposizione di collagene. ⁸ Correlato con il rilascio prolungato e prolungato di HMGB1 e guarito tramite la formazione di cicatrici in ferite generate oltre il giorno embrionale murino 16. ⁸ Tuttavia, Zhang et al. ^{9 hanno} concluso che l’HMGB1 diminuisce la sintesi del collagene fibroblasto in vitro.

L’eccessiva produzione di collagene osservata nei cheloidi potrebbe derivare dall’eccesso di HMGB1 o dall’aumentata reattività dei fibroblasti a HMGB1, suggerendo effetti simili di HMGB1 e trasformando il fattore di crescita beta (TGF-β) sull’induzione di cheloidi. Se HMGB1 è elevato in queste condizioni, il potenziale terapeutico dell’inibitore della chinasi chinasi della proteina mitogenata, della scatola A, della glicirrizina, dell’anticorpo anti-RAGE e di altri inibitori dell’HMGB1 deve essere studiato. ^4,7

Questo studio caso-controllo valuta il ruolo di HMGB1 in pazienti con cheloidi confrontando il livello sierico in questi pazienti con controlli sani e correlando il livello di HMGB1 con gravità e durata della cicatrice.

Caso
clinico Quaranta pazienti di entrambi i sessi con cheloidi di qualsiasi dimensione sono stati reclutati dalla clinica ambulatoriale di dermatologia dell’ospedale Kasr Al Ainy (Il Cairo, Egitto). Tipo di pelle del paziente, secondo la scala di Fitzpatrick, ¹⁰ variava da 2 a 4; 1 paziente ha avuto albinismo. Un modulo di consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun paziente prima dell’inclusione nello studio.

Sono stati esclusi i pazienti con i seguenti criteri: gravidanza, immunosoppressione, terapia corticosteroidea sistemica a lungo termine, diabete, fibrosi renale e anamnesi dell’uso di qualsiasi trattamento per cheloidi nelle 4 settimane precedenti l’inizio dello studio.

È stata completata una valutazione completa del paziente, comprendente anamnesi, storia clinica della cicatrice (durata ed eziologia) e precedente terapia. Il grado di cicatrice è stato determinato secondo la scala cicatrice di Vancouver modificata. ¹¹ 

Gruppo di
controllo Sono stati reclutati 40 controlli di entrambi i sessi con un tipo di pelle ¹⁰ da 2 a 4. I criteri di esclusione consistevano in assenza di cicatrici cheloidi e nessun trial di terapia concomitante. Prima dell’inclusione dello studio, è stato ottenuto il consenso informato scritto da ciascun paziente. È stata registrata una valutazione completa del paziente, inclusa la storia medica.

Metodologia
Un campione di 3 mL di sangue intero è stato ottenuto da 40 pazienti con cheloidi e 40 controlli. I campioni furono immediatamente centrifugati; il siero supernatante risultante è stato mantenuto congelato a -20 ° C per il rilevamento e la quantificazione di HMGB1 mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

Il metodo ELISA sandwich è stato impiegato utilizzando il kit ELISA (SinoGeneClon Biotech Co, Ltd, Hang Zhou, Zhejiang, Cina). La piastra micro-ELISA fornita in questo kit è stata preceduta da un anticorpo specifico per HMGB1. I campioni sono stati aggiunti agli appositi pozzetti di micropiastra ELISA e combinati con l’anticorpo specifico. Quindi, un anticorpo di rilevazione biotinilato specifico per HMGB1 e coniugato di peridasi di avidina-rafano (A-HRP) è stato successivamente aggiunto a ciascun pozzetto della micropiastra e incubato. I componenti liberi sono stati lavati via. La soluzione di substrato è stata aggiunta a ciascun pozzetto. Solo i pozzetti che contengono HMGB1, anticorpo di rilevamento biotinilato e coniugato A-HRP sono risultati di colore blu. La reazione enzima-substrato fu terminata con l’aggiunta di una soluzione di acido solforico e il colore diventò giallo. La densità ottica (OD) è stata misurata spettrofotometricamente ad una lunghezza d’onda di 450 nm ± 2 nm. Il valore OD è proporzionale alla concentrazione di HMGB1. La concentrazione di HMGB1 è stata calcolata nei campioni confrontando la OD dei campioni con la curva standard.

La stabilità di HMGB1 durante il lavoro pratico ELISA è stata assicurata con le seguenti procedure: incubazione al buio a 37 ° C, avvolgimento della piastra ELISA in alluminio, seguendo tutte le istruzioni manuali ELISA e duplicazione di ciascun campione per evitare la disparità dei dati.

Approvazione etica per lo studio è stata ottenuta dal comitato etico di ricerca dermatologica Post conduction (Kasr Al Ainy Hospital).

Analisi statistica I
risultati sono espressi come media ± deviazione standard o come numero (percentuale). Il confronto tra i dati categoriali è stato eseguito utilizzando il test del chi quadrato. In base al test di normalità, il confronto tra i valori di diversi parametri nei 2 gruppi di pazienti è stato eseguito utilizzando il test t non appaiato o il test U di Mann-Whitney ogni volta che è appropriato. La curva operativa del ricevitore (ROC) è stata utilizzata per determinare gli indici diagnostici di HMGB1. La correlazione tra HMGB1 e la durata della cicatrice e la gravità della cicatrice nel gruppo trattato è stata eseguita utilizzando il test del coefficiente di correlazione di classificazione di Spearman. Il test di regressione logistica binaria è stato utilizzato per studiare l’effetto predittivo di HMGB1. Per l’analisi dei dati, è stato utilizzato SPSS per Windows, versione 16 (SPSS Inc, Chicago, IL). A P il valore ≤ 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Quaranta casi di cheloidi e 40 controlli sono stati arruolati in questo studio. L’età media del gruppo di controllo era 32,43 ± 11,93 anni (intervallo, 15-66 anni) e il gruppo trattato era di 26,81 ± 15,08 anni (intervallo, 5-62 anni). Non c’era alcuna differenza statisticamente significativa nel valore medio dell’età tra il gruppo di controllo e il gruppo del caso ( P = .069). Otto dei 40 controlli erano uomini (20,0%) e 20 pazienti nel gruppo trattato erano uomini (50,0%).

Non c’era alcuna differenza statisticamente significativa tra i 2 gruppi per quanto riguarda i tipi di pelle. Per il tipo di pelle 2, erano presenti rispettivamente 7 (17,5%) e 3 (7,5%) pazienti nei gruppi controllo e caso. Vi erano 19 (47,5%) pazienti del gruppo di controllo e 22 (55,0%) pazienti del gruppo di pazienti con controlli di tipo 3 e 14 (35,0%) e 14 (35,0%) pazienti con pelle di tipo 4. Uno (2,5%) pazienti in il gruppo dei casi aveva albinismo.

C’era una differenza statisticamente significativa nel valore medio di HMGB1 in caso di pazienti (74,38 ± 40,16) rispetto al valore medio nei controlli (52,00 ± 5,41; P = 0,001) ( Tabella 1 ).

Non c’era alcuna differenza statisticamente significativa nel valore medio di HMGB1 tra uomini (51,88 ± 5,79) e donne (52,50 ± 3,78) del gruppo di controllo ( P = .774) e tra uomini (79,25 ± 53,69) e donne (69,50 ± 19.46) del gruppo casi ( P = .720).

L’analisi ROC, applicata al livello HMGB1, ha mostrato il miglior profilo diagnostico con un’area sotto la curva di 0.898. Il punto di taglio migliore era 55 ng / mL. La sensibilità, specificità e accuratezza erano rispettivamente dell’82,5%, 87,5%, 85,0% ( Tabella 2 , Figura 1 ).

Un taglio di 55 ng / mL aveva una sensibilità e una specificità nel rilevare l’innalzamento di HMGB1 rispettivamente dell’82,50% e 87,50% ( Tabella 3 ).

La proteina di scatola 1 di gruppo ad alta mobilità è risultata essere un predittore di gravità della cicatrice (odds ratio [OR] = 1.557, intervallo di confidenza al 95% [CI], 1.073-2.258; P = .020) ma non un predittore per la durata della cicatrice ( OR = 0.980; IC 95%, 0.794-1.209; P = .848) ( Tabella 4 , Figura 2 ).

I cheloidi sono rimasti una sfida per i medici e un importante problema di qualità della vita per molti pazienti. I cheloidi causano problemi estetici oltre a dolore, prurito e contratture. ¹²Nonostante i progressi nel secolo scorso, molti pazienti ancora sperimentano gli effetti negativi di cicatrici eccessiva e attualmente sono senza un trattamento efficace.

Esistono numerose modalità per il trattamento dei cheloidi, ma tutti hanno risultati insoddisfacenti per pazienti e medici. Il corticosteroide intralesionale può migliorare la flessibilità della cicatrice, diminuirne il volume e l’altezza e ridurre il prurito e il dolore legati alla cicatrice. ¹³Il principale problema di questo trattamento è l’alta frequenza di effetti collaterali, fino al 63%, ¹⁴come ipopigmentazione, atrofia cutanea, teleangiectasia, inefficacia, dolore al sito di iniezione e osteoporosi secondaria ad una grande area di iniezione. ^{15 La} crioterapia è un’altra modalità terapeutica comune con effetti collaterali che includono ipo- e / o iperpigmentazione permanente, atrofia cutanea moderata, vesciche e dolore postoperatorio. ¹³Ulcerazioni della ferita, iperpigmentazione e dolore sono potenziali complicanze del trattamento con fluorouracile. ^{16 La} bleomicina è una modalità non comune per i cheloidi, ¹⁷ e gli effetti avversi di imiquimod comprendono irritazione e iperpigmentazione. ¹⁸ Il laser a granato di ittrio alluminio drogato al neodimio (1064 nm), il laser a colorazione pulsata con pompaggio flash (585 nm-595 nm) e il laser ad anidride carbonica sono stati usati frequentemente nel trattamento dei cheloidi ¹⁹ ; tuttavia, nessuna delle modalità laser disponibili ha prodotto una risposta soddisfacente fino al 2011. ²⁰ Nonostante le numerose modalità per il trattamento dei cheloidi, non esiste un regime terapeutico soddisfacente poiché l’esatta patogenesi non è ancora chiara. 

La proteina della scatola 1 di gruppo ad alta mobilità ha due funzioni. Come fattore di trascrizione intracellulare, HMGB1 si lega al DNA piegato per promuovere l’assemblaggio di complessi nucleoproteici, che è fondamentale nel processo di trascrizione, ricombinazione, replicazione e riparazione. Come mediatore extracellulare, HMGB1 agisce come una potente citochina infiammatoria. ⁴ Il rilascio di HMGB1 si verifica attivamente da monociti stimolati e macrofagi e passivamente da cellule necrotiche / danneggiate. ⁵ Esercita i suoi effetti legandosi ai recettori della superficie cellulare, in particolare i recettori per RAGE, TLR2 e TLR4. ²¹

Diversi studi hanno esaminato il ruolo potenziale dell’HMGB1 nella guarigione delle ferite, come l’aumento della vitalità, della proliferazione e della migrazione di cheratinociti e fibroblasti. ^4,7Inoltre, l’aggiunta di HMGB1 a cute murina diabetica con livelli di HMGB1 ridotti e guarigione delle ferite alterata ha aumentato la migrazione dei fibroblasti e il tasso di chiusura delle ferite. ⁷

Il ruolo di HMGB1 nei cheloidi è stato studiato nel presente studio. Poiché questa proteina è nota per avere un ruolo nella guarigione delle ferite e si trova in bassi livelli nella cute diabetica, è stato ipotizzato che l’innalzamento dell’HMGB1 possa giocare un ruolo nella patogenesi cheloide. Forse questo potrebbe essere un obiettivo per lo sviluppo di nuovi inibitori di HMGB1 per la prevenzione e / o l’inversione della formazione di cheloidi.

Sono stati prelevati campioni di sangue da 40 casi di cheloidi e 40 controlli per confrontare il livello di HMGB1 in entrambi i gruppi e correlare il livello con la gravità e la durata dei cheloidi. È stato rilevato un aumento statisticamente significativo di HMGB1 nel gruppo trattato rispetto al controllo ( P = 0,001) e il livello di HMGB1 è risultato correlato positivamente con la gravità ma non con il tipo o la durata della pelle. Per quanto a conoscenza degli autori, questo è il primo studio che confronta i livelli di HMGB1 in pazienti con cheloidi e controlli sani.

Considerando che HMGB1 svolge un ruolo nella cicatrizzazione delle ferite e nell’eccessiva cicatrizzazione, si è riscontrato che è elevato in altre malattie fibrotiche come lo scleroderma, la fibrosi cistica e la fibrosi polmonare. ²² Entezari et al. ^{23 hanno} riportato che l’inibizione dell’attività dell’HMGB1 è utile per trattare le malattie fibrotiche. Inoltre, Lee et al. ^{24 hanno} suggerito che l’HMGB1 promuova la guarigione delle ferite inducendo la proliferazione e la migrazione dei fibroblasti.

Traumi e danni ai tessuti innescano una risposta infiammatoria, necessaria per la riparazione dei tessuti post-lesione. L’infiammazione conseguente al danno tissutale è un processo dinamico guidato da numerosi mediatori dell’infiammazione. ²⁵ Il ruolo di HMGB1 nell’infiammazione come chemoattrattante per le cellule infiammatorie è stato definito, ma il recettore specifico (ad esempio, per RAGE, TLR2 o TLR4) coinvolto in questo fenomeno non è chiaro. ⁴

Inoltre, HMGB1 contribuisce direttamente alla formazione dei vasi attraverso la promozione della proliferazione, della migrazione e della germinazione delle cellule endoteliali (CE). Inoltre, HMGB1 può promuovere il rilascio di citochine proangiogeniche da EC e macrofagi. ²⁶

Evidenze emergenti indicano che HMGB1, un mediatore pluripotente, contribuisce a molte malattie fibrotiche e può essere un obiettivo terapeutico promettente per tali malattie. ²³Sulla base di questi fatti, è stato suggerito che HMGB1 potrebbe anche svolgere un ruolo nelle cicatrici eccessive come i cheloidi. L’eccessiva produzione di collagene osservata nei cheloidi potrebbe derivare da un eccesso di HMGB1 o da una maggiore reattività dei recettori dei fibroblasti a HMGB1, suggerendo effetti simili di HMGB1 e TGF-β sull’induzione dei cheloidi. Questo è il motivo per cui gli autori attuali raccomandano di esaminare il livello di questi recettori e la loro sensibilità negli studi futuri. L’elevato livello di HMGB1, insieme alla correlazione positiva nella gravità dei cheloidi, può portare alla possibilità di utilizzare agenti bloccanti HMGB1 nel trattamento di pazienti in cui altre forme di terapia sarebbero impraticabili. Inoltre, la proteina HMGB1 può essere mirata usando anticorpi anti-HMGB1. ²⁷

Non esiste un’unica modalità di somministrazione per il trattamento e sono necessari ulteriori studi per scegliere il modo migliore per prevenire e curare i cheloidi senza compromettere il ruolo di HMGB1 nella trascrizione. È possibile che l’iniezione intralesionale di terapie mirate con HMGB1 in cheloidi già formati possa aiutare il trattamento o che l’iniezione intralesionale in una ferita postoperatoria possa impedire l’ulteriore comparsa di cheloidi in un paziente con una storia nota di formazione di cheloidi. La possibilità di somministrazione sistemica di un agente bloccante HMGB1 per aiutare gli individui con formazione di cheloidi spontanei deve ancora essere esplorata. Tuttavia, studi futuri dovrebbero mirare ad aiutare il trattamento di cicatrici eccessive con HMGB1 considerando le sue 2 funzioni drammaticamente opposte nel corpo come fattore requisito biologicamente intrinseco e come citochina proinfiammatoria.

I limiti di questo studio includono la piccola dimensione del campione e non la misurazione dei recettori dell’HMGB1. Questo dovrebbe essere esaminato in studi futuri.

Questo studio ipotizza che ci sia un ruolo per HMGB1 in cicatrici eccessive e quindi bloccandolo può prevenire e trattare casi gravi di cheloidi. La ricerca futura dovrebbe concentrarsi sulla rilevazione del ruolo esatto di HMGB1 nelle cicatrici.

[Tratto da: www.woundsresearch.com ]