Le funzioni del PCSK9 nell’aterosclerosi non sono limitate alla regolazione del colesterolo LDL plasmatico

introduzione

La proproteina convertasi subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) è una proteina solubile sintetizzata come zimogeno che subisce una scissione autocatalitica nel reticolo endoplasmatico ( 1 ). Nel 2007, PCSK9 è risultato essere un ligando per il recettore delle lipoproteine ​​a bassa densità (LDLR), un recettore chiave della membrana cellulare nella regolazione dell’omeostasi del colesterolo ( 2 ). Le LDLR legano e interiorizzano le lipoproteine ​​a bassa densità (LDL) dal flusso sanguigno, liberando il sangue dalle lipoproteine ​​del colesterolo altamente arricchite. Il complesso LDL-LDLR è guidato al lisosoma dove le LDL vengono digerite e le LDLR vengono riciclate sulla superficie cellulare per continuare a eliminare le particelle LDL dalla circolazione. PCSK9 inibisce la ricircolarizzazione delle LDLR promuovendone la degradazione nei lisosomi insieme alle LDL ( 3). Questo effetto riduce notevolmente la presenza di LDLR sulla superficie cellulare dell’epatocita e, di conseguenza, vi è un aumento delle particelle LDL nel flusso sanguigno.

Sebbene il PCSK9 sia noto dal 2003 ( 4 ) e sia stato quasi immediatamente associato all’ipercolesterolemia ( 5 ), la conoscenza del suo ruolo potenziale sulla regolazione del metabolismo delle LDL e sulle malattie associate sta aumentando nel corso degli anni ( 6 , 7 ). È stato descritto per la prima volta che le mutazioni su PCSK9 che portano a varianti con guadagno di funzione della proteina erano responsabili di diversi casi di ipercolesterolemia familiare umana [FH; ( 8 , 9)]. L’FH è una malattia ereditaria in cui i pazienti hanno livelli plasmatici di LDL superiori a 190 mg/dL, contribuendo a un rischio elevato di formazione di placche aterosclerotiche e di eventi avversi coronarici. Al contrario, le mutazioni PCSK9 con perdita di funzione sono associate a livelli molto bassi di LDL nel sangue che riducono il rischio cardiovascolare associato ( 10 , 11 ). Questi dati hanno incoraggiato gli studi a verificare se il PCSK9 fosse un buon bersaglio per gli studi clinici per il trattamento dell’ipercolesterolemia. L’ipercolesterolemia è comunemente trattata con statine, che sono farmaci che inibiscono l’HMG-CoA reduttasi, un enzima chiave per la biosintesi del colesterolo che riduce la produzione di colesterolo e abbassa la concentrazione di LDL nel plasma. Tuttavia, alcuni pazienti presentano intolleranza alle statine che ostacola il trattamento ( 12). Sia l’espressione genica PCSK9 che quella LDLR sono regolate da SREBP2 [Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2; ( 13-15 ) ] . Quando i livelli intracellulari di colesterolo sono bassi (come dopo i trattamenti con statine), c’è l’attivazione di SREBP2 che promuove la trascrizione di PCSK9 e LDLR. Pertanto, sia i livelli di LDLR che quelli di proteina inibitrice di LDLR aumentano determinando un ciclo intrinseco che limita l’efficacia della terapia con statine ( 16-18 ) . L’attività trascrizionale di SREBP2 è regolata a monte dall’AMPK (proteina chinasi attivata da AMP). L’attivazione di AMPK porta alla fosforilazione di SREBP2 e alla sua incapacità di promuovere la trascrizione dei geni bersaglio ( 19 , 20 ).

I farmaci anti-PCSK9 hanno iniziato a essere sviluppati come approccio secondario per ridurre i livelli di colesterolo LDL nei pazienti ipercolesterolemici. Ad oggi, sono disponibili solo due anticorpi monoclonali mirati al PCSK9 per il trattamento dell’ipercolesterolemia: evolocumab e alirocumab. Sono stati testati rispettivamente nello studio OSLER ( 21 ) e nello studio ODYSSEY LONG TERM ( 22 ) ( Tabella 1). Entrambi gli studi hanno mostrato una diminuzione di circa il 60% delle particelle LDL nel sangue e una diminuzione degli eventi cardiovascolari inclusi infarto miocardico, angina instabile o ictus (2,18% nel placebo e 0,95% nei pazienti trattati con evolocumab nello studio OSLER e 5,1% nel placebo e 4,6% nei pazienti trattati con alirocumab nello studio ODYSSEY LONG TERM). Tuttavia, gli eventi cardiovascolari riportati durante questi studi erano troppo bassi per dimostrare una rilevanza clinica in quest’area. Lo studio FOURIER ha arruolato pazienti con pregressa malattia cardiovascolare aterosclerotica che erano in terapia con statine ( 23). I risultati hanno mostrato una riduzione del 59% del contenuto di LDL nel flusso sanguigno e una diminuzione degli eventi cardiovascolari tra cui mortalità cardiovascolare, infarto del miocardio, ictus, ospedalizzazione per angina instabile o rivascolarizzazione coronarica di oltre il 15% nei pazienti trattati con evolocumab dopo 26 mesi di follow-up. Lo studio ODYSSEY OUTCOMES in pazienti con sindrome coronarica acuta recente alla massima dose tollerata di statine ha dimostrato che la somministrazione di alirocumab era associata a un ridotto rischio di eventi cardiovascolari ischemici ricorrenti e anche a una ridotta mortalità ( 24). Infine, gli studi SPIRE 1 e SPIRE 2 erano studi randomizzati che hanno confrontato l’efficacia di bococizumab, un altro anticorpo anti-PCSK9, con il placebo in pazienti che avevano sofferto di eventi cardiovascolari precedenti. Questi studi non hanno mostrato benefici dal trattamento con bococizumab nonostante abbiano mostrato miglioramenti significativi per i pazienti con un alto rischio cardiovascolare. L’efficacia clinica è stata ridotta perché metà dei pazienti in terapia con bococizumab ha sviluppato anticorpi antifarmaco, probabilmente perché bococizumab è un anticorpo murino umanizzato contenente circa il 3% di sequenza murina. Al contrario, alirocumab ed evolocumab sono anticorpi con sequenza umana completa. I risultati negativi si sono conclusi con un’interruzione prematura della sperimentazione da parte dello sponsor ( 25 ).

Oltre agli anticorpi monoclonali, sono stati sviluppati altri approcci mirati al PCSK9. Inclisiran (un piccolo RNA di interferenza) e statine nei pazienti con malattia cardiovascolare aterosclerotica o ipercolesterolemia eterozigote hanno ridotto i livelli di PCSK9 nel sangue e i livelli di colesterolo LDL negli studi clinici di fase 3 ORION-9 e ORION-10/ORION-11 ( 26 , 27 ).

La regolazione dei livelli ematici di LDL ricchi di colesterolo non è l’unico ruolo che PCSK9 guida nella patogenesi dell’aterosclerosi. C’è un forte background che suggerisce ruoli alternativi per PCSK9 nello sviluppo dell’aterosclerosi ( 28 , 29 ). In effetti, una coorte prospettica di 4.232 uomini e donne di sessant’anni che vivono nella contea di Stoccolma ha dimostrato che, indipendentemente dai livelli plasmatici di LDL, i livelli di PCSK9 sono correlati con un’elevata probabilità di futuri eventi cardiovascolari (30 ) . In un altro studio che ha incluso 643 partecipanti, alti livelli plasmatici di PCSK9 erano correlati con una maggiore progressione dell’aterosclerosi indipendentemente dalle LDL, come misurato dalla formazione della placca carotidea e dall’area totale della placca ( 31). Tuttavia, gli studi prospettici non sono riusciti a dimostrare una relazione tra i livelli di espressione di PCSK9 e il rischio futuro di eventi cardiovascolari, nonostante abbiano rivelato correlazioni tra i livelli plasmatici di PCSK9 e i marcatori aterosclerotici tra cui colesterolo LDL, trigliceridi nel sangue o insulina (32 , 33 ) .

Questa recensione discuterà il ruolo di PCSK9 nella modulazione dell’attività di diversi lignaggi cellulari coinvolti nella progressione dell’aterosclerosi inclusi macrofagi, cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), cellule endoteliali (EC), linfociti e piastrine e il rischio cardiovascolare associato. Commenteremo i ruoli degli effettori PCSK9 dimostrando che si estendono ben oltre la regolazione delle particelle LDL e riveleremo nuove intuizioni grazie alle quali gli inibitori PCSK9 possono ridurre l’incidenza della progressione dell’aterosclerosi.

PCSK9 modula i recettori di assorbimento dei lipidi dei macrofagi

L’aterosclerosi è comunemente descritta come una malattia infiammatoria cronica che inizia con un eccesso di accumulo di colesterolo nella parete vascolare che innesca l’infiammazione ( 34 ). I macrofagi sono cellule infiammatorie che svolgono un ruolo chiave nell’assorbimento dei lipidi e nella progressione dell’aterosclerosi. Nel 2012, è stato dimostrato che le LDLR espresse sulla superficie dei macrofagi umani erano sottoregolate dal PCSK9 prodotto da VSMC, riducendo la capacità dei macrofagi di internalizzare le molecole LDL native ed evitando la formazione di cellule schiumose, indicando che i macrofagi stimolati dal PCSK9 riducono le cellule schiumose formazione e, quindi, ridurre la progressione dell’aterosclerosi ( 35). Tuttavia, le molecole LDL native non sono la principale fonte di accumulo di colesterolo nei macrofagi. Dopo lo stravaso vascolare, le molecole LDL subiscono diverse modifiche tra cui l’aggregazione e l’ossidazione. L’aggregazione e l’ossidazione delle LDL si verificano dopo che i componenti della matrice extracellulare come i glicosaminoglicani ( 36 ) o i proteoglicani condroitin solfato ( 37 ) trattengono le particelle LDL native e facilitano la loro modifica da parte di diversi enzimi secreti tra cui la fosfolipasi A2 secretoria, la sfingomielinasi, la lipossigenasi o la mieloperossidasi ( 38-40 ) . Le particelle LDL modificate generano LDL aggregate (agLDL) e ossidate (oxLDL), che sono la principale fonte di accumulo di esteri di colesterolo nei macrofagi e nelle VSMC [ Figura 1; ( 41-44 ) ] . I macrofagi non interiorizzano agLDL o oxLDL attraverso LDLR ma attraverso un diverso gruppo di recettori chiamati recettori scavenger ( 45 ) e proteine ​​correlate a LDLR [LRP; ( 46-48 ) ] .

I recettori scavenger, tra cui il recettore scavenger A (SRA), il cluster di differenziazione 36 (CD36) e il recettore 1 della lipoproteina a bassa densità ossidata simile alla lectina (LOX-1) promuovono l’endocitosi delle particelle oxLDL nei monociti e nei macrofagi e la loro espressione è notevolmente aumentata sotto diversi stimoli infiammatori tra cui il lipopolisaccaride (LPS) o il fattore di necrosi tumorale-α [TNFα; Figura 1 ; ( 49 , 50 )]. Le caratteristiche principali dei recettori scavenger sono riassunte nella Tabella 2. Gli LPS sono componenti principali della membrana esterna dei batteri Gram-negativi che sono riconosciuti dal recettore Toll-Like 4 (TLR4) espresso nella superficie cellulare del macrofago. Il legame di LPS a TLR4 innesca una risposta intracellulare che attiva le vie MAPK e NFκB innescando l’infiammazione. I livelli di espressione di PCSK9 sono aumentati nei macrofagi di topo dopo la stimolazione con LPS come risultato dell’attivazione dell’inflammasoma NLRP3 (NOD-Like Receptor Protein 3). Infatti, NLRP3 e i suoi segnali a valle IL-1β, IL-18 e caspasi 1 partecipano tutti alla secrezione di PCSK9, come confermato da specifici esperimenti di delezione genica ( 51 ).

L’espressione di PCSK9 nei macrofagi dopo la stimolazione del TNFα si basa sulla generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Gli inibitori di ROS difenileniodonio (DPI) e apocinina riducono l’espressione di PCSK9 mentre gli induttori di ROS piocianina e antimicina A aumentano il rilascio di PCSK9 dimostrando che PCSK9 è espresso durante le procedure proinfiammatorie dei macrofagi ( 50 ). La produzione di ROS dipende dalla NADPH ossidasi. Dopo la stimolazione del TNFα, la mancanza di diverse subunità complesse della NADPH ossidasi riduce la quantità di recettori scavenger sulla superficie dei macrofagi ( 50 ). La somministrazione ricombinante di PCSK9 aumenta SRA, CD36 e LOX-1 sia a livello genico che proteico nei macrofagi di topo in coltura. In concomitanza, l’assorbimento di oxLDL è aumentato ( Figura 1). Questo aumento dell’assorbimento lipidico è abolito nei macrofagi privi di SRA, CD36 o LOX-1, suggerendo che tutti e tre i recettori sono coinvolti nell’assorbimento di oxLDL e, di conseguenza, nella generazione di cellule schiumose nell’aterosclerosi (50 ) . La tabella 2 riassume il coinvolgimento e la regolazione dei recettori scavenger e LDLR in diversi processi associati all’aterosclerosi.

Altri recettori della superficie cellulare espressi nei macrofagi modulati da PCSK9 sono LRP1, LRP5 e LRP8. Questi recettori appartengono alla sottofamiglia LRP della superfamiglia dei recettori LDLR e conservano il caratteristico dominio EGF che permette il legame al PCSK9 ( 52 ). I livelli di superficie di LRP1, insieme a LDLR, sono sottoregolati dal PCSK9 umano nei macrofagi di topo aterosclerotico inducendo un aumento dell’espressione genica dei marcatori proinfiammatori TNFα e IL-1β e una diminuzione dell’espressione genica dei marcatori antinfiammatori IL-10 e arginasi-1 che indicano un potenziamento del macrofago polarizzazione verso un fenotipo pro-infiammatorio ( 53). LRP8 (noto anche come apoER2), un recettore noto per il riconoscimento della proteina ApoE, è anche sottoregolato in seguito al legame PCSK9 ricombinante in diverse linee cellulari tra cui HEK293, fibroblasti 3T3, CHO, NeuroA2 e HuH7 (54 ) . Abbiamo recentemente descritto che LRP5 è richiesto per l’internalizzazione dei lipidi nei macrofagi umani poiché in assenza di PCSK9 e/o LRP5, i macrofagi mostrano un ridotto accumulo di esteri di colesterolo ( 55 ). Entrambe le proteine ​​formano un complesso nell’area perinucleare dei macrofagi umani che immunoprecipita insieme. La loro interazione è più forte nei macrofagi carichi di lipidi ( 55). Inoltre, i macrofagi silenziati per LRP5 mostrano un rilascio ridotto di PCSK9, indicando che LRP5 è coinvolto nel rilascio solubile di PCSK9, probabilmente partecipando al trasporto intracellulare di PCSK9 alla membrana plasmatica (55 ) . Inoltre, mostriamo anche che il complesso LRP5-PCSK9 regola la segnalazione TLR4 / NFκB per favorire l’infiammazione dei macrofagi. È interessante notare che i livelli superficiali di LRP5 rimangono inalterati dal PCSK9 secreto ( 55 ).

Infine, VLDLR, un recettore che appartiene anche alla superfamiglia LDLR e mostra una struttura simile a quella di LDLR, è anch’esso sottoregolato dal legame PCSK9. Infatti, il trattamento delle cellule HEK293 o dei fibroblasti 3T3 con PCSK9 ricombinante umano mostra una sottoregolazione dei livelli di espressione di VLDLR ( 54 ). È noto che sia VLDLR che LRP8 generano segnali antinfiammatori nei macrofagi ( 56 ).

PCSK9 modula l’infiammazione vascolare

Il PCSK9 è prodotto principalmente nel fegato, nei reni e nell’intestino tenue ( 4 ). Tuttavia, è espresso anche nelle cellule vascolari comprese le cellule endoteliali (EC) e le cellule muscolari lisce vascolari [VSMC; ( 35 , 57 , 58 )]. Le cellule vascolari sono influenzate da fattori emodinamici come il flusso sanguigno che, inducendo lo stress da taglio della parete, svolgono un ruolo critico nello sviluppo e nella progressione dell’aterosclerosi ( 59 ). Le EC e le VSMC umane in condizioni di basso flusso sanguigno hanno un’espressione proteica PCSK9 più elevata rispetto alle cellule in condizioni di flusso sanguigno elevato, un effetto conservato anche dopo la stimolazione con LPS. Infatti, aorte da Wti topi hanno mostrato un’espressione di PCSK9 significativamente più elevata nelle regioni ad alto stress di taglio, un effetto ulteriormente potenziato dalla somministrazione di LPS ( 60 ). Inoltre, nei conigli alimentati con una dieta ricca di grassi, le regioni aortiche a basso flusso avevano un’espressione di PCSK9 più elevata mentre le regioni con un flusso elevato come l’arco aortico mostravano un’espressione di PCSK9 vascolare inferiore [Figura 1 ; ( 61 )]. Pertanto, esiste una correlazione negativa tra i livelli di espressione vascolare di PCSK9 e il flusso sanguigno.

PCSK9 ha dimostrato di promuovere l’infiammazione vascolare. Il legame di PCSK9 al recettore infiammatorio TLR4 è stato inizialmente ipotizzato dall’omologia strutturale del dominio C-terminale di PCSK9 e del ligando TLR4 resistina nelle simulazioni in silico ( 62 ). I TLR sono recettori cellulari che riconoscono i patogeni e regolano l’espressione di citochine pro-infiammatorie e anche le prime risposte immunitarie all’infezione ( 63 ). Tra i TLR, TLR4 agisce come recettore per LPS e attiva NF-κB per promuovere una risposta infiammatoria ( 64). L’espressione di PCSK9 in EC e VSMC dipende dalla via di segnalazione TLR4/NFκB poiché l’inibizione di diversi componenti della cascata di attivazione mostra che l’espressione di PCSK9 si basa sull’asse TLR4-MyD88-NFkB ed è indipendente dalla segnalazione TLR4/TRIF, postulando la MyD88 percorso come possibile bersaglio per future terapie per prevenire un’eccessiva produzione di PCSK9 nel sistema vascolare ( 61 ). Quindi, la sintesi di PCSK9 è regolata dalla via di segnalazione del recettore TLR4 attraverso l’attivazione di MyD88 e NFκB, e il PCSK9 solubile può agire come mediatore infiammatorio mediante il legame e il riconoscimento di TLR4, come dimostrato nei topi knockout ApoE ( 65 ).

La stabilità vascolare dipende dall’apoptosi cellulare. PCSK9 modula l’espressione dell’induttore dell’apoptosi Bax e dell’inibitore dell’apoptosi Bcl-2. L’equilibrio tra queste due proteine ​​è fondamentale per prevenire o innescare l’apoptosi ( 66 , 67 ). Le cellule endoteliali cariche di lipidi mostrano un aumento dei livelli di proteina Bax e una diminuzione dei livelli di Bcl-2 che portano all’attivazione della caspasi 3 e della caspasi 9 inducendo l’apoptosi cellulare ( 68 ). Il silenziamento del PCSK9 da parte del siRNA inibisce l’apoptosi poiché il PCSK9 silenziato non può fosforilare p38 e JNK (entrambi membri della via di segnalazione MAPK) consentendo l’attivazione dell’inibitore dell’apoptosi Bcl-2 ( 69 – 72). È interessante notare che p38 e JNK sono anche responsabili della fosforilazione di Bax e Bad che attivano la morte cellulare programmata ( 73 , 74 ). Quindi, PCSK9 potrebbe promuovere l’attivazione della cascata di segnali MAPK e l’apoptosi delle cellule endoteliali [ Figura 1 ], un meccanismo che è già stato descritto nelle cellule tumorali ( 75 ).

PCSK9 partecipa alla formazione della placca

La formazione della placca è un processo complesso che include la ritenzione delle lipoproteine, il reclutamento di cellule infiammatorie, la proliferazione delle VSMC, la sintesi della matrice, l’apoptosi e la necrosi ( 76 ). Diverse linee di evidenza sostengono che il PCSK9 promuova la formazione della placca nei topi e nell’uomo ( 29 , 67 , 77 ). Infatti, PCSK9 aumenta l’assorbimento di LDL da parte dei recettori scavenger dei macrofagi contribuendo alla formazione di schiuma cellulare ( 50 ); favorisce l’infiammazione della parete vascolare aterosclerotica inducendo l’espressione di molecole di adesione, chemiotattici e citochine infiammatorie ( 78 ) e induce l’apoptosi delle ECs riducendo la stabilità del vaso ( 69). Inoltre, l’aumento dei livelli di espressione di PCSK9 è associato a un basso shear stress ( 60 , 61 ). Pertanto, PCSK9 è un obiettivo efficiente per lo sviluppo di terapie per la prevenzione e il trattamento della formazione della placca aterosclerotica.

La terapia anti-PCSK9 nei topi ha ridotto della metà l’area della placca nella radice aortica e l’infiltrazione di macrofagi pro-infiammatori nella placca aterosclerotica è stata ridotta ( 79 ). I livelli sierici di CXCL1, CXCL3 e CXCL10 (noti agenti chemiotattici per i leucociti), prodotti principalmente da EC e VSMC, erano ridotti ( 79 ). Inoltre, i topi knockout Pcsk9 mostrano una ridotta espressione della molecola di adesione delle cellule vascolari 1 (VCAM-1), una proteina necessaria per l’adesione delle cellule immunitarie alla parete vascolare ( 57 ).

La vaccinazione anti-PCSK9 è un’alternativa alla terapia con anticorpi monoclonali. La vaccinazione prevede la coniugazione di un peptide (8-13 aminoacidi) che imita il dominio N-terminale del PCSK9 maturo a una proteina trasportatrice che conferisce proprietà immunogeniche per attivare il sistema immunitario. Si ottengono sintesi di anticorpi specifici dell’ospite contro PCSK9 che generano inibizione a lungo termine. La terapia vaccinale mira a superare gli svantaggi della terapia con anticorpi monoclonali, tra cui brevi emivite in vivo , frequenti somministrazioni di dosi e costi elevati ( 80). Nei modelli murini di aterosclerosi, l’inibizione dell’attività del PCSK9 attraverso la vaccinazione ha ridotto l’espressione della molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) nella radice aortica malata e di conseguenza si è verificata una riduzione dell’adesione dei monociti e della migrazione verso l’endotelio che ha contribuito a una riduzione dell’aterosclerosi lesioni ( 81 ). Il vaccino anti-PCSK9 AT04A, che genera una risposta immunitaria umorale persistente contro PCSK9 per 1 anno nei topi, ha ridotto il contenuto di LDL di oltre il 50% ( 81 ). Ha anche ridotto l’espressione dell’inflammasoma NLRP3 nei macrofagi ( 81 ), un potente induttore per l’espressione e la secrezione di PCSK9 nei macrofagi necessari per la formazione e la progressione delle placche aterosclerotiche ( 51 ).

Nell’uomo, la terapia con inibitori PCSK9 aggiunta alla terapia con statine è in grado di aumentare l’ispessimento del cappuccio fibroso nei pazienti con sindrome coronarica acuta, riducendo la vulnerabilità della placca ( 82 ). Tuttavia, le capacità di riduzione del colesterolo LDL sia degli inibitori PCSK9 che del trattamento con statine non possono spiegare solo l’aumento dello spessore del cappuccio fibroso, suggerendo che potrebbe essere coinvolto un effetto pleiotropico sconosciuto come un effetto antinfiammatorio indipendente dall’abbassamento del colesterolo LDL (82) .). Il trattamento con inibitori PCSK9 in un modello murino aterogenico ha aumentato il numero di cellule progenitrici endoteliali circolanti e di cellule angiogeniche circolanti, marcatori di salute endoteliale e vascolare associati a esiti positivi come ridotta incidenza di eventi cardiovascolari e morte associata a cause cardiovascolari (83 ) .

Ruolo di PCSK9 nell’infiammazione nel sistema immunitario adattivo

È stato studiato il ruolo di PCSK9 durante la progressione dell’aterosclerosi nel sistema immunitario adattativo. Le cellule dendritiche (DC) ei linfociti T sono localizzati nella placca aterosclerotica, di solito in siti soggetti a rottura ( 84 ). Le DC funzionano principalmente come cellule che presentano l’antigene ai linfociti T. Essi fagocitano gli antigeni e li presentano ai linfociti T in un processo che coinvolge i complessi MHC e TCR (rispettivamente nelle DC e nei linfociti T). Nelle placche di ateroma, le DC presentano frammenti di oxLDL ai linfociti T che vengono poi attivati ​​( 85 ). L’importanza dell’attivazione delle cellule T nell’aterosclerosi è stata dimostrata perché i topi ApoE knockout e immunodeficienti (topi con immunodeficienza combinata grave senza linfociti B e T funzionali) avevano meno lesioni aterosclerotiche rispettoSolo topi knockout ApoE . Inoltre, i linfociti T CD4 da topi ApoE knockout trasferiti a topi ApoE knockout immunodeficienti inducono la generazione di lesioni aterosclerotiche ( 86 ). PCSK9 è indotto da oxLDL nelle DC e migliora l’espressione delle proteine ​​coinvolte nell’attivazione delle cellule T tra cui CD80, CD83, CD86 e HLA-DR e la produzione di citochine pro-infiammatorie tra cui TNFa, IL-1β e IL-6. L’espressione di tutte queste proteine ​​è stata ridotta quando il PCSK9 è stato messo a tacere e i livelli di espressione di TGFβ e IL-10 sono aumentati ( 87) .). Le cellule T attivate da DC stimolate da oxLDL producevano principalmente IFNγ e IL-17, indicando una polarizzazione verso un fenotipo antinfiammatorio Th1/Th17. Queste cellule T regolatrici anti-infiammatorie inibiscono la formazione di cellule schiumose e invertono il fenotipo pro-infiammatorio dei macrofagi riducendo la progressione dell’aterosclerosi ( 88 ). PCSK9 è una molecola chiave nella risposta Th17 poiché i topi aterosclerotici Pcsk9/Ldlr/Apobec (apolipoproteina B mRNA-editing catalytic polypeptide-1) avevano una produzione di Th17 significativamente inferiore rispetto ai topi aterosclerotici Ldlr/Apobec double knockout. Ciò è stato associato a cambiamenti nelle diverse fonti cellulari di Th17 (linfociti Th17 o γδTCR ⁺cellule T). Infatti, i topi privi di PCSK9 avevano un numero ridotto di linfociti Th17 e una ridotta espressione di RORγT, il fattore di trascrizione necessario per la differenziazione dei linfociti Th17 ( 89 ).

Un lavoro molto recente mostra che PCSK9 sottoregola l’espressione delle proteine ​​MHC di classe I nelle cellule tumorali promuovendone l’internalizzazione e la degradazione nei lisosomi (in modo simile a quello di PCSK9 con LDLR). Pertanto, PCSK9 diminuisce la risposta dei linfociti T citotossici contro il tumore ( 90 ). In un contesto aterosclerotico sembra plausibile che le LDL modificate possano stimolare cellule presentanti l’antigene come DC o cellule B a produrre una varietà di citochine che guiderebbero la differenziazione dei linfociti T verso un particolare sottotipo infiammatorio.

Ruolo di PCSK9 nell’ipercolesterolemia familiare

Nel 2003, dopo la scoperta delle mutazioni gain-of-function di PCSK9 nei pazienti FH, i primi anticorpi monoclonali contro PCSK9 sono stati testati in studi preclinici e clinici (inclusi ODYSSEY LONG TERM, ODYSSEY OUTCOMES e FOURIER) dimostrando l’efficacia nel ridurre i livelli plasmatici di colesterolo LDL nei pazienti ( 91 ). Nel 2020 una recente sottoanalisi degli studi FOURIER e ODYSSEY OUTCOMES ha rivelato che l’inibizione del PCSK9 nei pazienti con aterosclerosi stabile e iperlipidemia in terapia con statine riduce significativamente il rischio di tromboembolia venosa supportando un ruolo protettivo per gli anticorpi antiPCSK9 nelle malattie cardiovascolari umane ( 92). Gli anticorpi monoclonali contro PCSK9 sono anche in grado di invertire il fenotipo pro-infiammatorio dei macrofagi aterogenici nei pazienti con FH. Gli inibitori di PCSK9 hanno ridotto l’espressione di CCR2, CX3CR1 e integrine CD11b e CD18 nei monociti circolanti, suggerendo una minore capacità di infiltrazione e chemoattrattiva. Il trattamento con anticorpi PCSK9 ha ridotto la produzione di TNFα da parte dei monociti mentre la produzione della citochina antinfiammatoria IL-10 è stata potenziata ( 93 ). Infatti, i monociti circolanti di pazienti FH erano arricchiti con goccioline lipidiche nonostante l’espressione non rilevabile di LDLR ma l’aumentata espressione di CD36 e SRA [ Figura 1 ; ( 93 )]. Inoltre, la proteina ABCA1, una proteina responsabile dell’efflusso di colesterolo nei macrofagi, è stata inibita dall’espressione di PCSK9.94 ). Presi insieme, questi risultati suggeriscono che i monociti circolanti sono precondizionati nei pazienti FH a causa dell’attività PCSK9, che migliora la loro capacità di infiltrazione, l’accumulo di lipidi e l’attività pro-infiammatoria. In effetti, uno studio prospettico con pazienti eterozigoti FH sottoposti a terapia standard con statine ha rivelato una correlazione positiva tra i livelli circolanti di PCSK9 e gli eventi avversi cardiovascolari ( 95 ).

PCSK9 e trombosi piastrinica

Diversi fattori di rischio associati a malattie cardiovascolari, inclusa l’iperlipidemia, inducono disfunzione endoteliale e portano a trombosi arteriosa o venosa ( 96 ). Nelle arterie con progressione aterosclerotica in corso, la rottura della placca aterosclerotica è la principale causa di trombosi ( 97 ).

I topi knockout Pcsk9 mostrano una ridotta trombosi dell’arteria carotidea indotta da FeCl ₃ (una tecnica per indurre rapidamente e con precisione la formazione di trombi) in arterie e vene di dimensioni diverse ( 98 ). Dopo la stimolazione con FeCl3 _, il 70% dei topi knockout Pcsk9 ha sviluppato trombi non occlusivi non stabili dopo 30 minuti, mentre il 57% dei topi Wt ha mostrato un’occlusione totale dell’arteria prima di 15 minuti dopo la somministrazione di FeCl3, _suggerendo un ruolo per PCSK9 nella reattività piastrinica ( 98 ). . Inoltre, le piastrine di Psk9i topi knockout mostrano una significativa riduzione dei livelli di espressione della glicoproteina IIB/IIIA, dei livelli di espressione della P-selectina e degli aggregati piastrinici-leucocitari circolanti rispetto ai topi Wt indicando una minore attivazione piastrinica nei topi knockout Pcsk9 ( 98 ). Allo stesso modo, i topi knockout Pcsk9 mostrano anche una ridotta formazione di trombi dopo la legatura della vena cava inferiore rispetto ai topi Wt ( 99 ). I trombi generati dalla legatura della vena cava inferiore nei topi knockout Pcsk9 hanno meno attaccamento leucocitario poiché il reclutamento dei leucociti dipende dalla P-selectina e CXCL1, che sono sottoregolati nei topi knockout Pcsk9 ( 100) .). Tuttavia, non è noto se questo reclutamento di cellule infiammatorie sia sottoregolato a causa del ruolo di PCSK9 nell’assorbimento dei lipidi o perché PCSK9 ha funzioni indipendenti dai lipidi sullo stato stazionario delle piastrine (la Figura 2 illustra alcuni dei meccanismi mediante i quali PCSK9 induce la trombosi ) .

La NETosis è il processo mediante il quale i neutrofili rilasciano il loro contenuto di nuclei composto da DNA e proteine ​​antimicrobiche tra cui elastasi dei neutrofili e istoni, creando reti di fibre extracellulari che intrappolano e facilitano l’uccisione di agenti patogeni (101 ) . La NETosi è legata alla trombosi perché provoca l’attivazione, l’aggregazione e l’adesione piastrinica ( 102 ) e promuove l’inizio della cascata della coagulazione ( 100 ). Nei topi knockout per Pcsk9 la NETosi è significativamente ridotta, nonostante il numero totale di neutrofili e leucociti nel sangue sia aumentato, suggerendo che il PCSK9 può indurre la trombosi stimolando la NETosi [ Figura 2 ; ( 99 )].

Lo studio PCSK9-REACT è uno studio osservazionale e prospettico in cui pazienti con sindromi coronariche acute recenti sono stati sottoposti a intervento coronarico e hanno ricevuto inibitori P2Y _{12 (} 103 ). P2Y ₁₂ è un chemocettore per l’adenosina difosfato (ADP) coinvolto nell’aggregazione piastrinica ( 104 ) e un bersaglio per i trattamenti di tromboembolia utilizzando antagonisti come ticagrelor o prasugrel ( 105 ). Lo studio ha rivelato una forte correlazione tra i livelli ematici di PCSK9 e la reattività piastrinica ( 103). Ha anche dimostrato che elevati livelli plasmatici di PCSK9 sono associati a futuri eventi coronarici poiché il 22% dei pazienti con i più alti livelli plasmatici di PCSK9 ha subito eventi coronarici, mentre solo il 2% dei pazienti nel terzile inferiore ha avuto eventi coronarici. In linea con questi risultati, il PCSK9 ricombinante umano aggiunto al plasma umano sano era in grado di aumentare significativamente l’aggregazione piastrinica e ridurre il tempo di ritardo dell’aggregazione quando le piastrine venivano stimolate con epinefrina (98 ) . La capacità di miglioramento delle piastrine è dovuta al fatto che l’aggiunta di PCSK9 ha aumentato del 36% il numero totale di piastrine che esprimono il marcatore di attivazione glicoproteina IIB/IIIA [ Figura 2 ; ( 98 )].

Una relazione tra i livelli plasmatici di PCSK9 e il numero totale di piastrine circolanti è stata anche dimostrata in pazienti con malattia coronarica stabile ( 106 ). Allo stesso modo, i pazienti con fibrillazione atriale mostrano una forte correlazione tra i livelli plasmatici di PCSK9 e la reattività piastrinica poiché livelli elevati di PCSK9 si correlano positivamente con un rischio elevato per questo evento cardiovascolare ( 107 ). Questi pazienti hanno anche un più alto tasso di aggregazione e reclutamento piastrinico in coincidenza con livelli di espressione più elevati di trombossano B ₂ (TxB ₂ , un marcatore di attivazione piastrinica), un rilascio più elevato di P-selectina e una maggiore formazione di ROS ( 108 ). Correlazione tra elevati livelli plasmatici di PCSK9 ed elevata escrezione urinaria di TxB₂ è stato trovato anche ( 108 ). Presi insieme, questi risultati mostrano che non solo il numero di piastrine, ma anche la reattività piastrinica viene potenziata quando i livelli plasmatici di PCSK9 sono elevati ( Figura 2 ).

L’incorporazione del colesterolo nelle membrane piastriniche induce la reattività piastrinica mentre la deplezione del colesterolo dalle membrane è associata alla stabilità piastrinica ( 109 ). Pertanto, l’inibizione del PCSK9 ridurrebbe i livelli plasmatici di LDL riducendo la reattività piastrinica. Infatti, il trattamento con statine nei pazienti ipercolesterolemici, è in grado di ridurre il colesterolo di membrana piastrinica ( 110 ). Rimane oggetto di discussione se PCSK9 eserciti un effetto diretto sulle piastrine o se gli effetti dipendano dalla dislipidemia generata dal legame di PCSK9 a LDLR. La dislipidemia induce la generazione di oxLDL e agLDL, che a loro volta facilitano l’attivazione piastrinica legando i recettori scavenger sulla superficie piastrinica, tra cui LOX-1 e CD36 ( 111 – 113). Una volta attivate, le piastrine sono in grado di ossidare le LDL, generando un feedback positivo di attivazione piastrinica ( 114 ). L’inibizione del PCSK9 riduce anche i livelli sierici della lipoproteina (a) [Lp(a)] nei pazienti con dislipidemia ereditaria ( 115 ). Poiché la Lp(a) migliora l’attivazione piastrinica e la trombosi ( 116-119 ), il PCSK9 può prevenire la trombosi abbassando i livelli di Lp(a) . Un effetto diretto del PCSK9 sulle piastrine, indipendente dai suoi effetti sulla dislipidemia, è stato recentemente dimostrato in quanto gli inibitori del PCSK9 possono aumentare lo stress ossidativo (come risultato dell’attivazione delle cascate di segnalazione Nox2 e cPLA2) e bloccare l’attivazione piastrinica nelle piastrine umane _Wt ( 108 ) . ).

Gli inibitori PCSK9 vengono testati per modulare l’attivazione piastrinica nell’uomo. I pazienti con ipercolesterolemia primaria con precedente trattamento con statine sono stati trattati per 12 mesi con alirocumab o evolocumab e dopo soli 2 mesi di trattamento è stata riscontrata una significativa diminuzione del marker di attivazione piastrinica CD62P (120 ) . Anche i livelli plasmatici di CD40 solubile, P-selectina solubile e fattore piastrinico 4 sono stati ridotti dopo 12 mesi di trattamento con statine e inibitori PCSK9. Lo studio mostra anche che i pazienti ipercolesterolemici con somministrazione aggiuntiva di acido acetilsalicilico alle statine e agli inibitori del PCSK9 hanno una ridotta aggregazione piastrinica ( 120). È stata osservata una tendenza nella riduzione dell’aggregazione piastrinica nei pazienti senza somministrazione di acido acetilsalicilico, ma non vi sono state differenze significative a causa del basso numero di pazienti che hanno seguito questo trattamento ( 120 ).

PCSK9 è anche coinvolto nella coagulazione del sangue. La formazione della coagulazione è un processo chimico complesso in cui i fattori di coagulazione del sangue circolante indurranno in sequenza le scissioni proteiche per generare trombina e fibrina ( 121 ). Una correlazione tra elevati livelli plasmatici di Fattore VIII della coagulazione del sangue (FVIII) e trombosi arteriosa è stata dimostrata in studi sia su animali che sull’uomo ( 122-124 ) . La sintesi e la clearance del FVIII (e quindi i livelli plasmatici di FVIII) sono regolate dal fegato. Infatti, LDLR e LRP1 espressi negli epatociti promuovono l’endocitosi e la degradazione del FVIII ( 125 – 128). Anche se non ancora dimostrata, una connessione tra PCSK9 e FVIII sembra plausibile. Infatti, la downregulation dell’espressione di LDLR nella superficie cellulare degli epatociti regolata dal PCSK9 induce un aumento dei livelli plasmatici di FVIII e quindi un aumento del rischio di trombosi e di eventi cardiovascolari ( 127 ). PCSK9 può anche ridurre l’espressione della superficie cellulare di LRP1 aumentando ulteriormente i livelli plasmatici di FVIII ( 53 , 129 ). Infine, nei pazienti che producono anticorpi anti-fosfolipidi, i polimorfismi nei geni PCSK9 e LDLR sono associati alla progressione della trombosi supportando un ruolo nella formazione della coagulazione per l’asse PCSK9-LDLR [Figura 2 ; ( 130 )].

Osservazioni conclusive

Poiché PCSK9 è stato descritto per la prima volta come l’induttore di alcune patologie FH, è stato riposto molto interesse nel raggiungimento di un efficace trattamento inibitorio. Gli inibitori del PCSK9 somministrati ai pazienti hanno rivelato un ruolo chiave del PCSK9 nella malattia aterosclerotica poiché la sua inibizione ha ridotto i livelli plasmatici di colesterolo LDL con migliori risultati clinici cardiovascolari, dimostrando un ruolo multifattoriale e fisiopatologico del PCSK9 nella progressione dell’aterosclerosi. È interessante notare che le funzioni di PCSK9 non regolano solo i livelli plasmatici di colesterolo LDL riducendo l’espressione epatica di LDLR. In effetti, recenti scoperte dimostrano che il PCSK9 sta anche modulando attivamente l’infiammazione, la formazione della placca e la trombosi. Quindi, i benefici osservati dalle terapie inibitorie del PCSK9 possono essere indotti non solo dalle sue capacità di riduzione dei lipidi plasmatici, ma anche dalla riduzione dell’impatto di molti altri meccanismi in cui è coinvolto il PCSK9 che promuovono attivamente l’aterosclerosi. Sfortunatamente, le informazioni sull’interattoma di PCSK9 sono ancora limitate e sono ancora necessarie ulteriori indagini sul ruolo dell’attività di PCSK9 su diversi percorsi di segnalazione per generare una visione chiara del pieno potenziale di PCSK9 durante la progressione dell’aterosclerosi. Nonostante PCSK9 sia stato studiato principalmente nelle malattie cardiovascolari, partecipa anche a meccanismi generali condivisi da molte altre malattie, e quindi è ipotizzabile che PCSK9 sia coinvolto nell’inizio e nella progressione di altre patologie con potenti componenti infiammatori o trombotici.